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细胞培养小知识

2020-04-01 13:06:06 14

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后,在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中,加入10ml预热的DMEM完全培养基,轻轻吹匀,离心,2000rpmX2min,弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗,弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基,轻轻吹打,接种于盘中,在含5%CO2的细胞培养箱中培养。


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二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时.去培养基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的,放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化,转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘,转移至15ml离心管,2000rpmX2min,弃上清液。

再加入10ml PBS(经高压灭菌,保存于40C),吹匀,吸取10微升进行计数,按照1×106/盘接种,在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。


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三、细胞冻存

细胞密度达到80%~90%时,去培养基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化,转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘,转移至15ml离心管,2000rpmX2min,弃上清液。

加入lml冻存液(90%血清,10%DMSO),放入冻存盒内(盒内有异丙醇,以保证温度降低的速度),立即放入一80℃冰箱内,过夜,第二天放入液氮中,可以保存至少两年,如不放人液氮,可以保存三个月。

冻存液的配制:70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,边滴边摇。


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要求:

1.无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内,解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵,但细胞在体外培养的过程中,缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此,渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力,实际应用中,260~320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4.气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境,氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环,为细胞生存、代谢与合成提供能量;二氧化碳既是细胞的代谢产物,是细胞生长的必需成分,又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2~7.4。

注意事项

(1)第一次开始培养某种细胞时,一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索,可以得到关于该细胞的详细信息,包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞(如原代培养的细胞),需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

(2)进入细胞间开始细胞培养时,必须严格按照步骤操作。

(3)预防细胞污染

(4)防止细胞交叉污染

扩展资料:

动物细胞培养:

在所有的细胞离体培养中,最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清:动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子,如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里,血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃,塑料等作为支持物。

⑶气体交换:二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节,不断维持所需要的气体条件。